Para desarrollar con éxito los productos bioterapéuticos con proteínas de gran tamaño molecular, con los que se pretende revolucionar los resultados clínicos para los enfermos, el sector biofarmacéutico dar acceso a métodos de investigación, medida y análisis. Al caracterizar los productos bioterapéuticos, la agregación es una propiedad de calidad crucial que hay que cuantificar sin alterar la integridad de la proteína. Para dicha función, se necesitan técnicas analíticas sensibles que permitan monitorizar y cuantificar los niveles de agregación de proteínas.
El problema de la agregación de proteínas.
La agregación de proteínas se produce durante la fabricación de productos terapéuticos a base de proteínas, ya que la expresión, purificación y formulación de dichos medicamentos puede dar lugar a la formación de agregados.
Una de las causas por la que se puede producir una respuesta inmunogénica en los pacientes, reduciendo la eficacia del medicamento es por los agregados de proteínas. Por esta razón, los agregados de proteínas están considerados una propiedad de calidad crucial en el desarrollo de productos biofarmacéuticos.
Durante el proceso de fabricación, formulación y ensayo de estabilidad, la relación de agregados respecto al fármaco activo libre se monitoriza debiendo permanecer su concentración a un nivel bajo.
Normas como la ICH Q6B especifican que los agregados deben resolverse del producto deseado y cuantificarse.
Un análisis preciso y fiable es esencial para caracterizar la agregación de proteínas, pero los científicos pueden enfrentarse a problemas de baja resolución y pocas muestras analizadas, por el uso de columnas inadecuadas.
Sec: La respuesta al desafío de la agregación.
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) consiste en la separación cromatográfica de biomoléculas en función de su tamaño en disolución y es la solución idónea para separar proteínas intactas de contaminantes, incluidos los agregados, excipientes, restos celulares y otras impurezas que se generan por la degradación.
Para conseguir estas tipos de separaciones de proteínas se necesitan unos niveles máximos de precisión y velocidad.
Para conseguir una caracterización exitosa de la agregación de proteínas mediante SEC son necesarios diversos elementos básicos, entre ellos, la preparación de muestras.
En la preparación de muestras para SEC, el aspecto mas importante es garantizar que dicha muestra sea soluble tanto en el disolvente como en la fase móvil. Para conseguir prolongar la vida útil de la columna, se deben filtrar las muestras para eliminar las partículas.
Otro factor esencial para la SEC es la selección de columna para el análisis de la agregación de proteínas. Las columnas para SEC suelen ser mucho mas grandes que las utilizadas en el resto de técnicas cromatográficas y funcionan con velocidades de flujo bajas.
Para conseguir la resolución y el tiempo de análisis deseados, se puede ajustar la longitud de la columna. Normalmente se deben usar columnas de 300 mm de longitud para conseguir la resolución necesaria.
Sin embargo, también se pueden utilizar columnas mas cortas, de 150 mm, aumentando así el número de muestras analizadas.
Para seleccionar las columnas para SEC se debe tener en cuenta su compatibilidad con la muestra y la fase móvil.
El tamaño de poro utilizado dependerá del rango de pesos moleculares en la muestra. Cuanto mayor sea la resolución que deseamos, menor deberá ser el tamaño de la partícula.
Las columnas Agilent Bio SEC-3 están diseñadas para obtener una caracterización rápida y precisa de la agregación de proteínas mediante SEC.
Estas columnas (empaquetadas con partículas pequeñas de alta eficiencia) permiten reducir el tiempo de análisis pudiéndose usar longitudes menores o velocidades de flujo mayores sin perder resolución.
La selección de una fase móvil adecuada es esencial para la integridad de la muestra. En la fase móvil se necesita un tampón o sales para eliminar las reacciones iónicas. Sin embargo, es muy importante que estas sustancias no se utilicen en exceso ya que podría producirse una interacción hidrofóbica.